1、基本工作原理
1）吸收的本質(zhì)：分光光度法是利用物質(zhì)對不同波長光的選擇吸收特性而建立起來的分析方法。通常利用棱鏡或光柵分光來取得單色光，使單色光連續(xù)地依次通過溶液，并測得該溶液對每一波長的吸收，得到吸收光譜曲線。吸收光譜來源于物質(zhì)對光的選擇吸收，這是物質(zhì)的宏觀現(xiàn)象，而吸收的本質(zhì)
是分子內(nèi)部運動和光相互作用的結(jié)果。當物質(zhì)的分子吸收一定能量或波長的光譜后，透過的光譜中有些波長被吸收就形成了吸收光譜。吸收的能量愈小，則相應的光的波長，吸收峰出現(xiàn)在較長波段。當吸收在紅外區(qū)時形成紅外吸收光譜，如果吸收能量愈大，則相應的波長愈短，吸收峰出現(xiàn)在較短波段，當吸收在紫外區(qū)產(chǎn)生紫外吸收光譜。
2）吸收定律—朗伯比耳定律：當一束平行單色光通過均勻的溶液時，其吸光度與溶液的濃度和厚度的乘積成正比。其數(shù)字表達式：A=KCL=LogI0/I=-LogT吸收定律數(shù)字表達式成立的前提：①，入射光為單色光，②，吸收過程中各物質(zhì)無相互作用，各物質(zhì)吸光度具有加和性，③，光與物質(zhì)的作用于吸收過程，沒有熒光散射和光化學現(xiàn)象，④，吸收物是一種均勻分布的連續(xù)體系，
3）影響分光光度法的原因：
a，輻射與物質(zhì)的非吸收作用引起的誤差，
b，熒光與光化學反應的影響，一般說來，熒光對分光光度測量產(chǎn)生的誤差可以忽略，多數(shù)情況下顯色體系的熒光效率很小，而且熒光發(fā)射是各向同性，只
有一小部分沿著透射光方向進入檢測器，使測量吸光度偏低，產(chǎn)生負偏離。熒光對吸收測量的影響極大程度上決定于儀器的吸收池和檢測器光學設計，
c，反射和散射，吸收定律只適用于均勻介質(zhì)的吸收體系，渾濁溶液因散射使實測吸光度增加，導致偏離比耳定律，
d，儀器的非理想性引起的誤差，
e，復色光對比耳定律的偏離，大多數(shù)光度計只能獲得接近于單色光的狹窄的光通帶，實際上仍是有復色光性質(zhì)，可導致偏離比耳定律。偏離的大小取決于二單色光的摩爾吸光系數(shù)差△ε，|△ε|很小時，可近似認為是單色光，在低濃度時，工作曲線仍為直線，但濃度較大時，隨濃度增大，A-C曲線彎曲愈嚴重，故比耳定律只適用于稀溶液，
f雜散光，雜散光是指進入檢測器的處于待測波長光譜帶寬范圍外的不需要的其它波長組分。其主要來源于分光光度計色散元件棱鏡或光柵、反射鏡、透鏡表面的散射，單色器內(nèi)壁灰塵及其它元件傷痕的反射和漫射等，雜散光可引起嚴重的測量誤差。在儀器能量處于最小的波長處，雜散光通常處于值（如氘燈220nm,鎢燈340nm），
g，狹縫寬度，狹縫寬度不僅影響光譜的純度，也影響吸光度值。在定量分析時，為了得到足夠的測量信號，應采用較大的狹縫，在定性分析時則采用較小的狹縫，當出射狹縫和入射狹縫的寬度相等時，狹縫寬度引起的誤差最小
i，不平行入射光的影響，比耳定律的前提條件之一是采用平行入射光束，以保證全部光束通過同一厚度的吸收介質(zhì)，當入射光束偏離平行性較大時，就明顯導致偏離比耳定律。如果儀器中光束中等強度偏離平行性，引起的吸光度測量誤差一般在0.5%以內(nèi)；
j，光度標尺的誤差，光度標尺即透射比準確度，其誤差大小直接影響光度測量的準確度。
2、性能指標釋義
1）光學系統(tǒng)：通常是指光學系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)形式，目前，國內(nèi)光度計行業(yè)常采用的機構(gòu)為自準式和CT式兩種結(jié)構(gòu)；
2）波長范圍：指光度計所能進行測試的波長值和最小值之差；
3）波長準確度儀器顯示波長與真實波長的接近程度，即儀器設定波長與實際波長的差值。每臺光度計都要在很多個波長點檢查波長準確度；波長準確度是分光光度計的一項重要技術指標，它對定性、定量及結(jié)構(gòu)分析結(jié)果影響極大。
4）波長重復性：波長重復性是儀器返回原波長的能力。它體現(xiàn)了波長驅(qū)動機械和整個儀器的穩(wěn)定性；
5）光譜帶寬（靈敏度，分辨力）：指一個尖峰光譜帶通過單色器出狹縫時，在檢測器上所檢測到的能量半寬度，用波長單位nm表示，從另一個角度理解這一概念會更通俗易懂：首先，單色器出狹縫不僅僅代表著狹縫的物理尺寸或幾何尺寸，他還代表著光學意義，這就是光譜帶寬，我們知道，來自單色器的光線不全是單一波長的光，而是一個狹窄的按波長大小順序排列的光譜帶，這一光譜帶包含波長的多少，用光譜帶寬來表示。光譜帶寬直接反應的是從單色器出來的光的單色性的好壞程度。該指標與儀器的分辨力和靈敏度很相似，但又有所不同，他們從不同的側(cè)面反應光度計性能的好壞。分辨力是指儀器分辨兩相鄰波長大小的能力，靈敏度是指在做低濃度測量時，當濃度改變一個單位時在檢測器上所引起信號的變化量，它受校正曲線（標準曲線濃度為橫軸，吸光度為縱軸）和儀器本身精密度的限制。兩種測量方法精密度相同時，校正曲線斜率越大越靈敏，而斜率相等時，精密度越高靈敏度越好。需要指出的是，為了得到準確的測試結(jié)果，儀器的光譜帶寬（SpectralBandwith簡稱SBW）和分析樣品的自然帶寬（NaturalBandwidth 簡稱NBW）之比應小于0.1 , 這樣可以得到99.5% 以上的測量準確度。
6）雜散光：雜散光是非選擇波長的光照射到檢測器上產(chǎn)生的信號。它是光度計分析誤差的一個重要來源，雜散光大會限制高濃度溶液分析的準確性。雜散光用T%表示；
7）光度范圍：指光度計在滿足各項技術指標下的測試范圍，用A或T表示；
8）光度準確度：指多次測定的平均值與真實值符合的程度；檢查光度準確度，通常是利用經(jīng)過仔細反復測量的中性濾光片作為標準光度片來檢測的。中性濾光片是一種對一定波長范圍內(nèi)的光具有幾乎相同的透射比（或吸光度）的濾光片，利用它對波長變化及帶寬變化不敏感的特性，來檢查儀器的光度準確度和重復性。
9）光度重復性：指在相同的條件下進行多次平行測定，各平行測定結(jié)果之間的符合程度；
10）噪聲：指儀器檢測到的非有用信號的總和，它是相對信號而言的。通常，分光光度計中的噪聲有兩個來源，一是來自于光源，二是來自于儀器內(nèi)部固有的電
子噪聲，比如：電源，放大器，AD轉(zhuǎn)換器等。要減少噪聲，提高信噪比，必須有一個良好的電氣設計。噪聲影響低濃度測試下的測量重復性，也影響測試準確度。噪聲可通過多次測量后取平均值部分消除；
11）飄移：指儀器隨時間推移偏離起始值的程度。它取決于光源的穩(wěn)定性，電氣器件的穩(wěn)定性等。對單光束儀器而言，開機預熱時間長短對漂移有很大影響。
12）基線平直度：指全波長范圍內(nèi)儀器噪聲的分布。
3、用途
可供物理學、化學、醫(yī)學、生物學、藥物學、地質(zhì)學等學科進行科學研究，是廣泛應用于化工、藥品、生化、冶金、輕工、材料、環(huán)保、醫(yī)學化驗等行業(yè)及分析行業(yè)中最重要的質(zhì)量控制儀器之一，是常規(guī)實驗室的儀器。
